Full text of "USPTO Patents Application 10687850"

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1 Or ir T ORGANISATION MONDIALE DE LA PROPRIETE 1NTELLECTUELLE

X JL Bureau international

DEMANDE INTERNATIONALE PUBLIEE EN VERTU DU TRAITE DE COOPERATION EN MATIERE DE BREVETS (PCQ

(11) Nume>o de publication internationale: WO 98/29740
(43) Date de publication Internationale: 9 juillet 1998 (09.07.98)

(51) Classification internationale des brevets 6 :
G01N 27/327, 33/543

(21) Numero de la demande Internationale: PCT/FR97/02440

(22) Date de de*p6t international: 29 ddcembre 1997 (29.12.97)

(30) Donnas relatives a la priority

96716201 30 ddcembre 1996 (30.12.96)

i (71) Deposant (pour tous les Etats designs sauf US): COMMIS-
1 SARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE [FR/FR]; 31-33, rue

de la Federation, F-75015 Paris (FR).

' Invented CLERC, Jean-Frederic

[FR/FR]; 8, rue Mont Perthuis, F-38120 Le Fontanil (FR).
MASSIT, Oaude [FR/FR]; 248, chemin des Peutes Roches,
F-38330 Saint-Ismier (FR).

| (74) Mandataire: BREVATOME; 25, rue de Ponthieu, F-75008
Paris (FR).

(81) Etats designes: JP, US, brevet europeen (AT. BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE).

Publiee

Avec rapport de recherche internationale.
Avant 1' expiration du d&lai privu pour la modification des
revendications, sera republiie si de telles modifications sont
recues.

(54) Title: MICRO SYSTEM FOR BIOLOGICAL ANALYSES AND METHOD FOR MAKING SAME
(54) Titre: MICROSYSTEME POUR ANALYSES BIOLOGIQUES ET SON PROCEDE DE FABRICATION

(57) Abstract

The invention concerns
I a micro system for biological
I analysis for detecting analytes,
j for example antigens* in a
sample. The micro system
I comprises: an isolating
substrate (1) coated with a
I first conductor (3) forming
a first electrode, and .a
I second conductor (7) bearing
a plurality of conductive
I elements (7) extending above
the first conductor so as
to form a second coplanar
electrode arranged at a distance
I d from the first conductor, and
means (13, 15) for polarising
the first and second conductors.
The eleccrode(s) are covered
: with a specific Hgand. After a
sample has been introduced on

Sou

ZfL^X^^U- in the sample can be detected by measuring the impedance between electrodes 3 and 7, which will
indicate the formation or not of an analyte-ligand layer on the electrqde(s).

(57) Abr£ge*

L/invention conceme un microsysteme pour analyse biologique, destine a la detection d'analytes, par exemple d'antigenes, dans un
6chantillon. Le microsysteme comprcnd: un support isolant (I) revetu d'un premier conducteur (3) formant une premiere Electrode, et d'un
second conducteur (5) supportant une plurality d'616ments conducteurs (7) s'6tendant au-dessus du premier conducteur de facon a former
une seconde electrode coplanaire disposee a une distance d du premier conducteur, et des moyens de polarisation (13, 15) du premier et du
second conducteur. La ou les 61ectrode(s) sont recouvertes d'un .ligand specifique. Apres introduction d'un echantillon sur le support, on
peut d6tecter la presence d'analyte dans I'echantillon par mesure de Pimp6dance entre les Electrodes (3 et 7), qui traduira la formation ou
non d'une couche analyte-ligand sur la (les) electrode(s). •

UNIQUEMENT A TITRE D'INFORMATION

Codes utilises pour identifier les Etats parties au PCT, sur les pages de couverture des brochures publiant des demandes
intemationales en vertu du PCT.

Albanie

Espagne

Lesotho

Slovenie

Armenie

Finlande

Lituanie

Slovaqute

Autriche

France

Luxembourg

Senegal

Australie

Gabon

Lettonie

Swaziland

Azerbaijan

Royanme-Uni

Monaco

Tchad

Botnie-Herzegovine

Georgie

Republique de Moldova

Togo

Barbade

Ghana

Madagascar

Tadjikistan

Bclgiquc

Guinee

Ex -Republique yougoslave

Turkmenistan

Burkina Faso

Grece

de MacetJoine

Turquie

Bulgarie

Hongric

Mali

Trinii6-et-Tobago

Benin

Iriandc

Mongolie

Ukraine

Bresil

Israel

Manritanie

Onganda

Belarus

Islande

Malawi

Etats-Unis d'Amerique

Canada

Italic

Mexique

Ouzb6k»tan

Republique centrafricame

Japon

Niger

Viet Nam

Congo

Kenya

Pays-Bas

Yougoslavic

Suisse

Kirghizistan

Norvege

Zimbabwe

C&e d'lvoire

Republique populaire

Nouvelle-Zaande

Camcroun

democratique de Coree

Poiogne

Chine

RepubBque de Coree

Portugal

Cuba

Kazakstan

Roumanie

Republique tcheque

Samte-Lucie

Federation de Rnssie

AHemagne

Liechtenstein

Soudan

Danemark

Sri Lanka

Suede

Estonie

Libena

SingapouT

WO 98/29740

PCIYFR97/02440

MICROS YSTEME POUR ANALYSES BIOLOGIQUES ET SON PROCEDE

DE FABRICATION

DESCRIPTION

Domaine technique

La presente invention a pour objet un
microsysteme pour analyses biologiques, utilisable

10 notamment dans le secteur de la sante, de l'industrie
agro-alimentaire et de 1' environnement .

Elle s' applique plus particulierement a la
realisation de microsystemes d' analyses biologiques
destines au diagnostic in vitro, notamment en analyse

15 des maladies infectieuses (detection du HIV, des
mycobacteries etc. ) .

Dans ces domaines oil il s'agit de faire des
economies de sante, on recherche actuellement des
microsystemes d' analyse a usage unique, qui soient

20 simples d'emploi, utilisent de tres faibles volumes
d' echantillon et "reposent sur le principe d'une
detection directed ne necessitant ni reactif de
detection (marqueur ou autre), ni amplification du
signal de detection.

Etat de la technique anterieure.

Depuis environ quatre ans,de nouveaux formats
de tests (multiaf finite, integration, de fonctions
30 telles que 1' amplification genique, separation par
electrophorese) ont fait leur apparition et leurs
applications industrielles semblent importantes, bien

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qu' aujourd' hui elles soient principalement localisees
dans le sequengage du genome humain.

Ces nouveaux tests . doivent surtout leur succes
a 1' introduction des microtechnologies dans le domaine

5 biologique, permettant ainsi, par 1' integration et la
parallelisation, d'atteindre des performances, des
vitesses et des sensibilites elevees. Par ailleurs, les
microtechnologies conduisent a des solutions nouvelles
tant techniques (miniaturisation, integration)

10 qu' economiques (production en masse) , de nature a
relancer le developpement des biocapteurs.

Ainsi, on a realise recemment des support de
tests pour la detection immunochimique directe,
constitues de couches minces de semiconducteur et de

15 silice avec des anticorps lies de fagon covalente a ces
couches, qui permettent de detecter la presence d'un
antigene capable de reagir avec ces anticorps par
mesure de . la capacite de 1' ensemble (voir reference

1 : Battaillard et al, dans Analytical Chemistry, 60,
20 1988, pages 2374-2379). Un autre microsysteme du meme

type a ete decrit par Schyberg et al, dans la reference

2 : Sensors and Actuators, B26-27, 1995, pages 457-460.

Les documents references 3 : FR-A-2 598 227 et
4 : EP-A-244 .326 decrivent aussi. un procede de

25 detection et/ou d' identification . d'une substance
biologique dans un echantillon liquide .4 i'aide de
mesures elect riques. Selon ce procede, on met en
contact 1' echantillon avec une plaque porte-reactif
comportant un ligand specifique de la substance

30 biologique a detecter, cette plaque pouvant etre
realisee en un materiau semi-conducteur tel que le
silicium, et etant revetue d'une couche isolante de
silice, puis on mesure les composantes C et/ou R de

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1' impedance electrique du • systeme pour detecter la
presence de la substance biologique dans 1' echantillon.

Tous ces systemes -font appel a la reaction de
reconnaissance entre la substance biologique a detecter
5 et un ligand specifique de cette substance pour
realiser une detection directe de cette derniere sans
avoir a utiliser d'autres reactifs ou moyens de
detection (marqueurs, reactions d' amplification du
signal etc) . En ef fet, cette reaction de reconnaissance

10 se traduit par la formation d'une couche active de tres
faible epaisseur, par exemple de 100 A a 1 000 A, qui
presente des caracteristiques electriques, par exemple
une capacite et une impedance, differentes de celles du
systeme en 1' absence de ladite couche.

15 Cependant, avec les systemes connus

actuellement la distance entre les electrodes de mesure
disposees de part et d' autre de la couche active reste
importante par rapport a 1' epaisseur de cette couche
active ; et ceci nuit a la sensibilite de detection.

20 La presente invention a precisement pour objet

un microsysteme d' analyse biologique, base sur le meme
principe, c'est-a-dire sur la reaction de
reconnaissance de la substance biologique ou analyte a
' detecter . avec un ligand. specifique, qui permet,

25 d'.effectuer la . mesure avec une distance . entre les
electrodes de mesure beaucoup . plus . faible et
d'.ameliorer de ce fait la sensibilite du dispositif .

Expose de 1' invention

Selon ■ 1' invention r le dispositif de detection
d'un analyte comprend : ■

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un support isolant revetu d'un premier
conducteur formant une premiere electrode, et d'un
second conducteur supportant une pluralite d' elements
conducteurs s'etendant au-dessus du premier conducteur
5 de fagon a former une seconde electrode coplanaire
disposee a une distance d du premier conducteur, et

- des moyens de polarisation du premier
et du second conducteurs.

Selon 1' invention l'une au moins des

10 electrodes, de preference les deux, sont recouvertes
d'un ligand specif ique L' de l'analyte a detecter.

De la sorte, lorsqu' on depose sur le support
isolant muni des electrodes un echantillon a analyser
au contact des deux electrodes, l'analyte A

15 eventuellement present dans cet echantillon va reagir
avec le ligand L pour former un complexe LA, soit une
couche active sur les electrodes. La formation de cette
couche pourra etre detectee en mesurant 1' impedance
entre les electrodes.

20 Avec le dispos.itif de 1' invention, la structure

coplanaire particuliere des electrodes permet de
disposer les deux electrodes . a une distance d tres
faible, par.exemple de 20 a 500 nm, qui est de l'ordre
de 2 a 5 fois l'epaisseur de la couche active formee

25 par reaction de l'analyte avec le ligand specif ique se
trouvant sur les electrodes. Ainsi, - la mesure
d' impedance portera sur la couche elle-meme et non sur
une couche d'air ou de fluide non representative du
phenomene de reconnaissance entre l'analyte et le

30 ligand specif ique.

Cette disposition particuliere des. electrodes
sur le meme support permet d'obtenir une multiplicite
de zones de recouvrement entre les premieres et

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. deuxiemes electrodes . entrainant une grande surface
totale de recouvrement repartie. La repartition de la
surface de recouvrement et. 1' absence de second support
permet a 1' analyte un acces rapide aux electrodes par
5 rapport a un dispositif ou les electrodes sont chacune
sur un support distinct et ou le fluide doit penetrer
dans un espace situe entre deux structures epaisses.
Plus cet espace est faible, plus le fluide est gene
d'ou des problemes de temps d' acces et d' homogeneite .

10 Par ailleurs, cette disposition permet

d' augmenter la surface developpee des electrodes et
d'obtenir ainsi, lors de la mesure d' impedance de la
couche active formee, un rapport signal/bruit eleve.

Enfin, comme on le verra plus loin, les

15 elements conducteurs, realises par exemple sous forme
de champignons, presentent une bonne tenue mecanique,
ce qui permet de preserver la distance entre les
electrodes.

Selon un mode prefere de realisation du
20 dispositif de 1' invention, le premier . conducteur a la
forme d'un peigne a dents larges, le second conducteur
a la forme d' un peigne a. dents plus etroites, les dents
du second conducteur etant intercalees entre les dents
du , premier, conducteur et . supportant des elements
25. conducteurs s'etendant au-dessus des dents du premier
conducteur.

Le dispositif de 1' invention est utilisable
pour la detection d'analytes. de divers types. A titre
d' exemple de tels analytes, notamment dans le domaine
30 medical, on peut citer les antigenes, les haptenes, les
anticorps, les peptides, les fragments d'acide
nucleique (ADN ou ARN), les enzymes et les substrats
d' enzymes.

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Pour cette detection, conf ormement a
1' invention, 1'une au moins des electrodes du
dispositif est recouverte- d'un ligand specif ique de
1'analyte a detecter, par exemple par greffage direct

5 ou indirect de ce ligand sur la (les) electrodes.
Lorsque la (les) electrode (s) ainsi recouverte (s) sont
en contact avec un echantillon contenant l'analyte
correspondant , il se forme un complexe analyte-ligand,
ou couche active, sur la (les) electrode (s) , et on

10 detecte directement la presence de ce complexe par une
mesure electrique d' impedance .

Les ligands specifiques recouvrant la ou les
electrodes sont ceux qui presentent au moins un site de
reconnaissance de l'analyte et qui sont susceptibles de

15 se lier a ce dernier. Le couple ligand-analyte peut
ainsi appartenir aux couples antigene-anticorps,
haptene-anticorps, hormone-recepteur, ADN-ADN C , ARN-
ARN C , enzyme-substrat , ou tout autre association de
molecules biologiques ou non, capables de former entre

20 elles des complexes.

L' invention a egalement pour objet un proced6
de fabrication du dispositif decrit ci-dessus. Ce
procede comprend les etapes suivantes :

a) former sur un support isolant un
25 premier conducteur et un second conducteur espaces l'un

de 1' autre,

b) revetir le support isolant
cbmportant les premier et second conducteurs d' une
couche isolante,

30 c) graver cette couche isolante pour

mettre a nu des zones du second conducteur qui
serviront de plots de contact electrique,

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d) former sur ces zones et au-dessus de
la couche isolantes des elements conducteurs par
croissance galvanique d'un .metal ,et

e) eliminer la couche isolante par
5 dissolution dans un solvant, ne dissolvant ni les

premier et second conducteurs, ni le metal des elements
conducteurs ,

Selon une variante de realisation de ce
procede, celui-ci comprend de plus le depot d'une
10 couche metallique au-dessus de la couche isolante, qui
servira de fonds pour la croissance galvanique des
elements conducteurs et presentera des dimensions
correspondant a celles des elements conducteurs a
former.

15 Selon cette variante, les etapes d) et e) du

procede defini ci-dessus sont remplacees par les etapes
suivantes :

d' ) deposer sur 1' ensemble une couche
metallique, puis une couche . de resine de
20 photolithographic,

e') insoler la resine et la developper
pour mettre a nu des zones de la couche metallique
ayant les dimensions des Elements conducteurs a.
former,.

25 f ' ) former sur ces zones de.. la couche

metallique les elements conducteurs par croissance
galvanique d'un metal,

g' ) eliminer la resine et la couche
metallique sauf sur les endroits qui correspondent aux
30 elements conducteurs, et

h' ) Eliminer la couche isolante par.
dissolution dans un solvant, ne dissolvant ni les

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premier et second conducteurs, ni le metal des
elements.

Pour mettre en . oeuvre le procede de
1' invention, on peut utiliser soit un support isolant
5 en verre, soit un support isolant en silicium.

Dans le cas d'un support isolant en verre, on
forme de preference, les premier et second conducteurs
par depot de metal sur le support isolant aux endroits
correspondents. Ceci peut etre effectue par une
10 metallisation suivie d'une gravure pour definir les
zones conductrices correspondant aux premier et second
conducteurs.

Dans le cas ou 1'on part d'un support isolant
en silicium, on forme de preference les premier second

15 conducteurs sur ce support par implantation d'ions, par
exemple d'ions bore ou phosphore aux endroits voulus.

Dans les deux cas, on depose ensuite sur le
support comportant les premier et second conducteurs,
une couche isolante, par exemple de silice, que 1'on

20 grave ensuite pour definir sur le second conducteur les
plots de contact des elements conducteurs qui formeront
la seconde electrode. Ceux-ci peuvent etre obtenus par
croissance galvanique d'un metal tel que l'or.

Comme on le verra plus loin, les differentes

25 etapes de ..ce procede de fabrication peuvent etre
realisees par les techniques employees de facpon
classique en microelectronique.

Apres realisation de ces etapes, on effectue
generalement une etape complement aire de revetement du

30 premier conducteur et des elements conducteurs, soit
des electrodes du dispositif, par un ligand specif ique
de 1'analyte a detecter..

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Le mode de realisation de cette etape depend,
d'une part, du materiau constituant les electrodes et,
d' autre part, du ligand specif ique utilise.

D'autres caracteristiques et avantage de
5 I 7 invention apparaitront mieux a la lecture de la
description qui suit, donnes bien entendu a titre.
illustratif et non limitatif.

Breve description des dessins.

10 y

La figure 1 est une vue en perspective d'un
dispositif de detection conforme a 1' invention.

La figure 2 est une vue en coupe verticale du
dispositif de 1' invention suivant la ligne XX' de la
!5 figure 1.

Les figures 3 a 7 illustrent les etapes
principales de fabrication du dispositif de la figure 1
dans le cas ou le support isolant est un verre.

Les figures 8 a 12 illustrent une variante de
20 realisation du precede de fabrication illustre par les
figures 3 a 7 .

Les figures 13 a 17 illustrent un autre mode de
realisation du dispositif de la figure 1 adapte a
1'emploi d'un support en silicium. .

Expose detaille des mod^s de realisations •

Sur la figure 1, on a represents en perspective
un microsysteme pour analyse biologique conforme k
30 1' invention.

Ce microsysteme comprend un support isolant 1
muni sur sa surface superieure d'un premier conducteur
3 et d'un second conducteur 5. Le premier conducteur 3

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qui constitue l'une des electrodes du microsysteme, a
la forme d'un peigne dont les dents 3a sont
relativement larges par rapport a l'espace entre dents
successives.

5 Le second conducteur 5 a egalement la forme

d'un peigne comportant des dents 5a intercalees entre
les dents 3a du premier conducteur 3, ces dents 5a sont
plus etroites que les dents 3a et elles supportent des
elements conducteur 7 ayant la forme de champignons qui

10 s'etendent au-dessus du premier conducteur 3 a une
distance d de celui-ci. Les elements conducteurs 7
forment la seconde electrode du microsysteme. Les
electrodes 3 et 7 peuvent etre reliees a un circuit
electrique exterieur respectivement par les conducteurs

15 13 et 15 en vue de polariser les electrodes et
d'effecteur des mesure d' impedance entre celles-ci.

Sur la figure 2 qui est une coupe verticale du
dispositif de la figure 1 * selon la ligne XX' , on voit
que 1' element conducteur 7 en forme de champignon est

20 dispose a une distance d des dents 3a du premier
conducteur 3, en etant supporte par les dents 5a du
second conducteur. Comme on peut le voir sur cette
figure, la forme de champignon permet d' avoir une
surface d' electrode importante pour la reaction 1 de

25 reconnaissance de l'analyte a detecter.

Sur les figures' 3 4 7, on a represents de fagon
schematique la realisation du microsysteme de la figure
1 en partant d'un support isolant en verre. La
realisation est effectuee par un procede « froid »,

30 les etapes de . fabrication s'effectuant a des
temperatures ne depassant pas 300K.

La figure 3 illustre la realisation de . la
premiere etape du procede de fabrication selon laquelle

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on depose sur le support 1 les premier et second
conducteurs ayant la forme de peignes. Ceci peut . etre
effectue. par metallisation- du support. 1, suivie d'une
gravure qui permet de definir les zones conductrices

5 qui constitueront le premier conducteur en forme de
peigne 3 avec ses dents 3a et le second conducteur en
forme de peigne 5 avec les dents 5a. Ces peignes
peuvent etre realises en or, en alliage or-chrome ou en
alliage or-nickel-chrome . En effet, l'emploi d f or ou

10 d' alliage d'or permet, d'une part, d'obtenir ensuite
une bonne croissance galvanique des champignons et,
d' autre part, de realiser dans de bonnes conditions le
greffage sur les electrodes de molecules biologiques
qui constitueront le ligand specif ique de 1'analyte &

15 detecter.

Sur la figure 4> on a represents la realisation
des etapes b) et c) du procede de 1' invention.

Dans 1'etape b) on depose sur le support revdtu
obtenu dans la premiere etape, une couche isolante 6.

20 par exemple de silice, que l'on grave ensuite pour
mettre & nu les zones 7a correspondantes aux plots de
contact entre le second conducteur et les elements en
forme, de champignons. Ceci peut etre ef fectue . ... en
deposant a froid la. couche 6, par exemple par. PECVD

25 (depot chimique en phase vapeur active par. plasma.) ou
par depot ci la tourn^tte de silice colloidale. Les
trous correspondant aux plots : de cbntact sont ensuite
pratiques dans la couche 6 par photolithogravure .

On peut utiliser dans ce but une resine

30 organique photosensible au ultraviolets et eliminer la
couche de silice aux endroits voulus correspondant aux
plots de contact par dissolution dans l'acide
f luorhydrique . :On. obtient ainsi la configuration

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representee sur la - figure 4 ou les trous 7a
correspondent aux plots de contact des elements
conducteurs 7.

Sur la figure 5, on a illustre 1' etape d) du
5 procede de 1' invention. Dans cette etape, on forme les
elements conducteurs 7 en forme de champignons par
croissance galvanique de metal, en utilisant les plots
de contact comme electrodes de depot. Lorsque le metal
est de l'or ou un alliage d'or, elle peut etre
10 effectuee a temperature ambiante avec une tension de
polarisation de l'ordre du volt. Cette croissance
galvanique developpe directement la forme de
champignon.

Sur la figure 6, on a represents l'etape e) du

15 procede de 1' invention dans laquelle on retire la
couche de silice 6 par dissolution au moyen d'acide
f luorhydrique. On , obtient ainsi le dispositif
represents sur la figure 1.

En vue de son utilisation pour la detection

20 d'analyte, ce dispositif est soumis a une derniere
etape de revetement des deux electrodes par un ligand
specif ique de l'analyte a detecter. Dans ce but, on
modif.ie la surface des electrodes par exemple par des
thioalcanes lorsque les electrodes sont en or.

25 Sur les figures 8 a 12, on a represents une

variante de realisation 1 du procede decrit ci-dessus.

Dans cette variante, les . premieres etapes du
procede sont realisees comme il est illustre sur les
figures 3 et 4, mais apres gravure de. la couche de

30 silice et obtention de la configuration representee sur
la figure 4, on depose une couche continue de metal sur
1' ensemble du support.

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La figure 8 illustre cette etape qui peut etre
realisee par pulverisation cathodique d' un metal. Sur
cette figure, on voit la couche de metal 8.

Apres ce depot, on recouvre 1' ensemble d'une
5 resine de photolithographie qui sera durcie ensuite par
irradiation de fagon a devenir insoluble sur certaines
zones du substrat, la resine non durcie etant eliminee
par un solvant approprie.

Les figures 9 et 10 representent ces etapes .
10 Sur la figure 9, on voit le support recouvert de la
couche continue metallique 8 qui est revetu de la
couche de resine 9, par exemple la resine organique
photosensible aux ultraviolets.

Par insolation sur les zones voulues reperees
15 par des fleches, on durcit cette resine pour la rendre
insoluble.

Sur la figure 10, on a represents 1' ensemble
apres elimination de la resine non durcie, ce qui met a
nu la couche metallique 8 . sur des zones . qui
20 correspondent aux Elements conducteurs 7 £ former.

La figure 11 illustre la realisation des
elements conducteurs. 7. Ceci peut etre effectue par
croissance galvanique, par exemple d'or, dans les memes
conditions que celles decrites ci-dessus. On obtient la
25 structure representee sur la figure 11 ou les Elements
7 sont delimites dans la couche de resine durcie 9.

Bien entendu, on peut utilis'er a la place de la
resine durcissable, une resine susceptible d'etre
degradee et rendue soluble par irradiation, les zones
30 irradiees etant dans ce cas inversees.

Sur la figure 12, on a represents 1' etape
d' elimination de la couche de resine durcie 9 et de la
couche metallique 8 sur les zones qui ne correspondent

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pas aux elements conducteurs 7. Ceci peut etre effectue
par applications d'un plasma oxygene.

On obtient la structure representee sur la
figure 12 qui correspond sensiblement a celle de la
5 figure 5.

On realise ensuite l'etape d' elimination de la
couche 6 de.silice et l'etape de greffage d'un ligand
comme dans le cas des figures 6 et 7.

Sur les figures 13 a 17/ on a decrit un autre

10 mode de realisation du dispositif de la figure 1, a
partir d'un support isolant en silicium. Le procede
utilise est un procede de type microelectronique
silicium. Les etapes de fabrication sont compatibles
avec les lignes de fabrication de circuits CMOS.

15 La figure 13 illustre la premiere etape du

procede selgn laquelle on forme sur le support le
premier et le second conducteurs. Dans ce cas, on
realise les zones conductrices correspondant aux
peignes 3 et 5 par implantation d'ions dans le support

20 en silicium pour le rendre conducteur sur ces zones
representees par 3a et 5a sur la figure. Les ions
utilises pour 1' implantation sont par exemple des ions
de bore ou phosphore, et on realise 1' implantation a
travers un masque definissant les zones a implanter en

25 utilisant une 6nergie suffisante pour, rendre conducteur
le silicium sur ces * zones, sur une epaisseur de
quelques 1 000 A a 1 micron.

La figure ...14 illustre l'etape . b) du procede,
dans laquelle on forme sur 1' ensemble une couche

30 isolante 6. Cette couche isolante est de la silice qui
peut etre formee par oxydation thermique du silicium
sur 1' ensemble du support (zones implantees et non
implantees) . Apres cette etape, 1'epaisseur des zones

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15 .

implantees est plus - faib'le. La figure 9 illustre

egalement l'etape c) du procede de 1' invention dans

laqueile on grave la couche isolante 6 pour mettre a nu

certaines zones 7a du second conducteur qui serviront
5 de plots de contact. Cette gravure peut etre realisee

par photolithogravure dans . les memes conditions que

precedemment.

Sur la figure 15, on a represents l'etape

intermediaire de metallisation des plots de contact 10
10 qui peut etre effectuee par une metallisation complete

suivie d'une gravure localisee correspondant a

1' emplacement des plots de contacts.

La figure 16 represente l'etape de formation

des elements conducteurs au-dessus de la couche 6. Ceci
15 peut etre effectue par croissance galvanique comme dans

le cas de la figure 5.

La figure 17 represente I'Stape e)

d' elimination de la couche de . silice, par exemple .au

moyen d' acide f luorhydrique.
20 . La derniere etape du procede peut etre realis&e

comme precedemment en greffant sur les elements

conducteurs 7 et sur 1' electrode formee par le premier

conducteur 3 un ligand specif ique de l'analyte a

dStecter .

25 Lorsque le conducteur 3 et les elements 7 sont

en or ou en alliage d^or, on modifie la surface des
electrodes par des thioalcanes, puis on fixe le ligand
sur les surfaces d' or ainsi . modifiees. par reaction
entre le ligand et les. chaines terrriinales de

30 thioalcanes.

Lorsque le premier conducteur 3 est en
silicium r cette fixation peut etre effectuee par des
techniques classiques, par exemple par adsorption sur

WO 98/29740

PCT7FR97/02440

1' electrode apres. 1' avoir oxydee tres

superficiellement, ou par formation d'une liaison
covalente entre 1' electrode et le ligand en utilisant
un reactif de couplage bif onctionnel capable de reagir
a la fois avec 1' electrode et avec le ligand.

L' utilisation de tels reactifs est bien connue.
A titre d'exemple de reactif convenant pour le couplage
de ligands constitues par des anticorps, des proteines
et des peptides, sur le siliciura, on peut citer les
derives de silane comportant un groupe alkoxysilane et
un groupe NH 2 separes l'un de 1' autre par une chaine
hydrocarbonee. Des techniques de ce type sont decrites
dans les references 1, 3 et 4 citees precedemment .

Ainsi, on peut modifier chimiquement le
silicium par un alcoxy ou un chlorosilane comportant
une fonction capable de reagir avec le ligand
specif ique, par exemple un groupe terminal-CN, -NH2 ou
-SH. En effet, ces groupes sont capables de reagir
apres activation par un agent f onctionnel approprie,
avec les groupements de molecules telles que des
fragments d' anticorps et des oligonucleotides.

A titre d'exemple d' alcoxy silane utilisable,
on peut citer les composes de formules :

C2H5— O — Si— (^n-R 2
R1

dans laquelle R 1 represente CH 3 , C 2 H 5 , OCH 3 ou OCH 2 H 5 , R 2
represente -CN, -NH 2 ou -SH, et n est un nombre entier
de 1 a 17.

WO 98/29740

PCT/FR97/0Z440

De tels composes se fixent sur le silicium par
reaction avec les hydroxyles libres, selon le schema
reactionnel :

— OH |

— OH + C 2 H 5 — o — Si — (CH 2 ) n -R 2

— OH I

— OH |
O — Si— (CH 2 ) n -R 2

^OH

Lorsque R 2 represente NH 2 , on peut fixer sur ce
groupe un fragment d' oligonucleotide par des reactions
classiques.

I0 Lorsque R 2 represente SH, on peut fixer sur ce

groupement un fragment d'anticorps egalement par des
reactions de couplage classiques.

On precise que les techniques utilisables pour
realiser les differentes etapes de fabrication du
15 microsysteme sont celles de la microelectronique /

L' utilisation des microtechnologies permet
notamment :

- d'ameliorer la sensibilite du d.ispositif
(controle precis dea geometries, des parametres

20 optiques ou electriques) ,

- d'ameliorer la specif icite de la
detection en utilisant . plusieurs dispositifs du meme
type sur une seule plaquette de silicium (redondance,
detection multiple),

WO 98/29740

PC17FR97/02440

- d'ameliorer la fiabilite de la detection
en s' affranchissant des problemes de pollutions
localisees ou de reactions .non specifiques, et

- d'obtenir une reduction du cout de
5 fabrication ( miniaturisation des elements sensibles,

utilisation des techniques collectives d' hybridation et

de packaging developpees pour les microsystemes) .

Ainsi, ces dispositifs fabriques par des

procedes de microtechnologies of f riront-ils aux
10 utilisateurs finaux, notamment aux laboratoires

d' analyse decentralises, l'avantage d'une haute

praticabilite .

Le dispositif de ' 1' invention dont les elements

conducteurs 7 et eventuellement le premier conducteur 3
15 ont ete revetus d' un ligand specif ique approprie, peut

etre utilise pour la detection d'analyte de la fa<?on

suivante.

On depo-se sur la plaquette support 1 une goutte
de 1'echantillon a analyser. Etant donne les dimensions

20 de la plaquette, la goutte recouvre les elements 7 et
1' electrode 3. Si 1' echantillon contient l'analyte A,
il. se forme une couche active sur la surface des
electrodes 3 a et 7 par formation du complexe L-A qui
occupe pratiquement toute 1'epaisseur d entre les

25 electrodes. On detecte la presence de cette couche par
une mesure de 1' impedance entre ces electrodes.

Ceci peut etre effectue 'en appliquant aux
electrodes 3 et 5 une tension appropriee et en mesurant
1'intensite du courant circulant entre ces electrodes.

30 En comparant cette mesure avec une mesure effectuee
dans les memes conditions en 1' absence d'analyte, on
peut verifier si 1'epaisseur de la couche sensible a
augmente et en deduire la presence ou non d'analyte.

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References citees :

- (1) Battaillard et al, Analytical Chemistry,

60, 1988, pages 2374-2379.
5 - (2) Schyber et al, Sensors and Actuators,

B26-27, 1995, pages 457-460.

- (3) FR-A-2 598 227

- (4) EP-A-244 326 :

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REVENDICATIONS

1. Dispositif de detection d'un analyte,
comprenant :

5 - un support isolant (1) revetu d'un

premier conducteur (3) formant une premiere electrode,
et d'un second conducteur (5) supportant une pluralite
d' elements conducteurs (7) s'etendant au-dessus du
premier conducteur de fagon a former une seconde
10 electrode coplanaire disposee a une distance d du
premier conducteur, et

- des moyens de polarisation (13, 15)
du premier et du second conducteurs.

2. Dispositif selon la revendication 1, dans
15 lequel 1'une au moins des electrodes est recouverte

d'un ligand specif ique L de 1/ analyte A a detecter.

3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2,
dans lequel le premier conducteur a la forme d'un
peigne a dents larges (3a) , le second conducteur a la

20 forme d'un peigne a dents plus etroites (5a), les dents
du second conducteur etant intercalees entre les dents
du premier conducteur et supportant des elements
conducteurs (7) s'etendant au-dessus des dents du
premier conducteur.

25 4. Dispositif selon. 1'une quelconque des

revendications 1 ou 2, dans lequel la distance d est de
20 a 500 nm.

5. Dispositif selon 1'une quelconque des
revendications 1 a 4, dans lequel le support est en
30 verre, le premier et le second conducteurs sont
realises en metal et les elements conducteurs sont en
metal.

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6. Dispositif. selon la revendication 5, dans
lequel le metal est l'or ou un alliage d'or.

7. Dispositif selon 1'une quelconque des
revendications 1 a 4, dans lequel le support est en

5 silicium, le premier et le second conducteurs sont en
silicium rendu conducteur par implantation d'ion, et
les elements conducteurs formant la seconde electrode
sont en metal.

8. Dispositif selon la revendication 7, dans
10 lequel le metal es£ l'or.

9. Procede de fabrication .d'un dispositif
selon la revendication 1, comprenant les etapes
suivantes :

a) former sur un support isolant (1) un
15 premier conducteur (3) et un second conducteur (5)

espaces l'un de 1' autre,

b) revetir le support isolant
♦ comportant les premier et second conducteurs d' une

couche isolante (6),
20 c) graver cette couche isolante pour

mettre a nu des zones (7a) du second conducteur qui
serviront de plots de contact electrique, ...

d) former sur.ces zones et au-dessus de
la couche isolante des elements conducteurs (7) par

25 croissance galvanique d'un metal ,et

e) eliminer la couche isolante (6) par
dissolution dans un solvant, ne 'dissolvant . ni les
premier et second conducteurs, ni le metal des elements
conducteurs.

30 10. Procede de fabrication d' un dispositif

selon la revendication 1, comprenant les etapes
suivantes :

WO 98/29740

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a) former sur un support isolant (1) un
premier conducteur (3) et un second conducteur (5)
espaces l'un de 1' autre,

b) revetir le support isolant
comportant les premier et second conducteurs d'une
couche isolante (6)/

c) graver cette couche isolante pour
mettre k nu des zones (7a) du second conducteur qui
serviront de plots de contact electrique,

/ d) deposer sur 1' ensemble une couche

metallique (8), puis une couche (9) de resine de
photolithographic,

e) insoler la resine et la developper
pour mettre a nu des zones de la couche metallique
ayant les dimensions des elements conducteurs (7) a
former, .

f ) former sur ces zones de la couche
metallique les elements conducteurs (7) par croissance
galvanique d'un metal,

g) eliminer la resine (9) et la couche
metallique. (8) sauf sur les endroits qui correspondent
aux elements conducteurs (7) , et

h) Eliminer la couche isolante (6) par
dissolution dans un solvant, ne dissolvant ni les
premier, et second conducteurs, ni le metal des
elements.

11. Procede selon l'une quelconque des
revendications 9 et 10, comportant en outre une etape
de revetement du premier conducteur et des elements
conducteurs par un ligand L specif ique de l'analyte a
detecter.

12. Procede selon l'une quelconque des
revendications 9 a 11, dans lequel 1' etape a) consiste

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a deposer un metal sur le support isolant aux endroits
correspondant aux premier et second conducteurs.

13. Procede selon l'une quelconque des
revendications 9 a 11, dans lequel le support etant en

5 silicium, on forme sur ce support le premier et le
second conducteurs par implantation d'ions.

14. Procede selon l'une quelconque des
revendications 9 a 13, dans lequel dans l'etape b) , on
depose une couche de silice sur le support comportant

10 les premier et second conducteurs, on grave cette
couche dans l'etape c) par photolithogravure, et on
elimine cette couche en fin d' operation par dissolution
dans l'acide f luorhydrique .

15. Procede selon les revendications 11 et 12,
!5 dans lequel le metal des elements conducteurs etant de

1'or, on modifie celui-ci par des thioalcanes avant de
revetir les elements par le ligand specifique de
l'analyte a dete'cter.

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A. CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER

IPC 6 G01N27/327 G01N33/543

According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC

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C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT

Category * Citation of document with indication, where appropriate, of the relevant passages

Relevant to claim No.

EP 0 244 326 A (810 MERIEUX) 4 November
1987

cited In the application
see the whole document

WO 94 23287 A (DENKI KAGAKU KEIKI KK
;KARUBE ISAO (JP); CHEN CHIEN YUAN (CN);
YAG) 13 October 1994
see abstract

-/-

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Patent family members are listed In annex.

• Special categories of cited documents : .

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considered to be of particular relevance
"E" earlier document but published on or after the international

fiting date

V document which may throw doubts on priority daim(s) or
which Is cited to establish the publication date of another
citation or other special reason (as specified)

"0* document referring to an oral disclosure, use, exhibition or
other means

"P" document published prior to the international fifing date but
later than the priority date claimed

T later document published after the international filing date
or priority date and not in conflict wfth the application but
cited to understand the principle or theory underlying the

invention

"X" document of particular relevance; the claimed Invention
cannot be considered novel or cannot be considered to
Involve an Inventive step when the document Is taken alone

"V document of particular relevance; the claimed Invention
cannot be considered to Involve an inventive step when the
document is combined wfth one or more other such docu-
ments, such combination being obvious to a person sklled
In the art K

document member of the same patent f amity

Date of the actual completion of theintemational search

23 April 1998

Date of maiflng of the International search report

04/05/1998

Name and mailing address of the ISA

European Patent Office, P.B. 5818 Patentlaan 2
NL - 2280 HV Rljswijk
Tel. (+31-70) 340-2040, Tx. 31 651 epo rt.
Fax (+31-70) 340-3016

Authorized officer

Moreno, C

Foim PCT/ISA/210 (second sh««t) (JUly 1992)

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Im itlonal Application No

PCT/FR 97/02440

C(Contlnuatlon) 0OCUMENTS CONSIDERED TO 8E RELEVANT

Category * Citation of document, with Indteatloawhor* appropriate, ol ihe relevant passages

Relevant to daim No.

C. SCHYBERG ET AL; "Impedance analysis of

S1/S102 structures grafted with

blomolecules for the elaboration of an

immunosensor. "

SENSORS AND ACTUATORS B,

vol. 26-27, 1995, LAUSANNE CH,

pages 457-460, XP002039082

cited In the application

see the whole document

P. BATAILLARO ET AL: "Direct detection of

immunospedes by capacitance measurements"

ANALYTICAL CHEMISTRY,

vol. 60, 1988, COLUMBUS US,

pages 2374-2379, XP002039081

cited in the application

see the whole document

Form PCT/ISA/21 0 {continuation erf second «b»*t) (Jury 1 992)

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RAPPORT DE RECHERCHE INTERNATIONALE

0. .rtde Intematlonaie No

PCT/FR 97/02440

C.<sulte) DOCUMENTS CONSIDERES COMME PERTINENTS

Categorle « Identification des documents cites, avecie cas echeant, Hndicatlondes passages pertinents

no. des revendlcattons vieees

C. SCHYBERG ET AL: "Impedance analysts of

S1/Si02 structures grafted with

biomolecules for the elaboration of an

Immunosensor."

SENSORS AND ACTUATORS B,

vol. 26-27, 1995, LAUSANNE CH,

pages 457-460, XP002039082

cite dans la demande

voir le document en entier

P. BATAILLARD ET AL: "Direct detection of

Immunospedes by capacitance measurements"

ANALYTICAL CHEMISTRY,

vol. 60, 1988, COLUMBUS US,

pages 2374-2379, XP002039081

cite dans la demande

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ForcmiaJru PCT/ISA/21 0 (siite de la dauaama fauiSe) fliiUot 1 992)

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RAPPORT DE RECHERCHE INTERNATIONALE

D nde Internationale No

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publication

EP 0244326 A

04-11-87

FR
DE
DE
ES
PT

2598227 A
3787041 A
3787041 T
2002695 T
84810 B

06-11-87

23- 09-93

24- 03-94
01-01-94
29-12-89

W0 9423287 A

13-10-94

AU 6292494 A

24-10-94

Fomudair* PCT/1SA/21 0 (vmu tamffl w do btwoa) QuUet 1 992)

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